① 【急】【高分】在做Real-Time PCR之前，cDNA的濃度要調平嗎cDNA濃度怎麼算啊
看你實驗要求，一般實驗設計中沒必要這么做
現在做絕對定量的很少，如果相對定量，只要找好對照基因即可。
你可能想檢查自己的某個基因A表達是否發生變化了，提取了兩個樣品的cDNA，這種情況下，無需將兩個樣品的cDNA調整到相同濃度。而是找一個在兩個樣品中表達基本認為不變的持家基因B，然後對兩個樣品中的A和B同時都進行實驗。通過檢測不同樣品中A與B的比值，就可以知道A基因表達是否發生變化了。
② 有關cdna文庫應包含多少克隆的計算公式
部分基因文庫
cDNA是指以mRNA為模板,由逆轉錄酶催化形成的互補DNA(cDNA),其核苷酸序列完全互補於模板mRNA鏈;再以cDNA為模板,由DNA聚合酶合成第二鏈,得到互補雙鏈DNA.由於模板mRNA含有該種細胞的各種mRNA分子,因而合成的cDNA產物是各種mRNA拷貝的混合物,然後將雙鏈產物與載體(質粒或噬菌體)DNA重組,並轉化到宿主細菌或包裝成噬菌體顆粒,得到一系列重組的克隆混合體.每個克隆含單獨一種mRNA分子,克隆總和則包含細胞的全部mRNA信息,即cDNA文庫.
③ 實時定量數據處理時對照組的基因相對表達量怎麼計算
熒光定量PCR之後計算目的基因的相對表達量一般採用2-△△ct的方法。
我們還是假設對照組和處理組各有三個生物學重復（即對照組3個cDNA樣品cDNA1, cDNA2, cDNA3，處理組3個cDNA樣品cDNA4, cDNA5, cDNA6），三個技術重復（即每個cDNA的每個基因點三個孔）。
熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒游標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。隨著PCR反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化。
結合相應的軟體對產物進行分析，可以得到熒光擴增曲線，計算待測樣品初始模版的量。實時熒光定量PCR技術是一次由定性技術向定量技術的飛躍，運用該項技術，可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析。
④ 逆轉錄cDNA有40ul體系嗎
逆轉錄cDNA有40ul體系。
要通過分光光度計進行測定，算出總RNA的含量，取10ulRNA提取液，稀釋300倍，以同體積的水作為對照，用UV-2401紫外分光光度計測RNA260nm處和280nm處的吸收值並計算純度公式OD260/OD280。濃度公式=總濃度（ng/nl）=（OD260）*（稀釋倍數n）*40。
制備cDNA
制備互補DNA，往往需要先分離從目的基因轉錄來的mRNA.如果該基因編碼的蛋白質是細胞中的主要蛋白質，則此基因的產物是總mRNA的主要組成部分。
就胰島B細胞而論，此細胞含有高水平胰島素前體mRNA，後者有時可以沉澱正在翻譯的mRNA的核糖核蛋白體，如果用特異抗體結合所表達的蛋白質(抗原)，則可從沉澱的核糖體中分離出胰島素特異的mRNA，一般特異mRNA只是細胞總mRNA中的次要成分。
⑤ 1000ng/ul的RNA反轉成cDNA是多少
300到500ng。RNA是核糖核酸的縮寫1000ng/ulc，DNA是一種互補脫氧核糖核酸根據反轉公式反轉量在30到50%其就是300到500ng。
⑥ 高中生物老師cDNA可以理解為什麼是DNA-RNA的結合體還是雙鏈DNA
cDNA是雙鏈DNA。
在高中生物里可能是為了方便只提了第一步里的逆轉錄酶，事實上在整個製作步驟中，你可以看到由第一鏈產生第二鏈的過程中是需要DNA聚合酶的。
不用在意這些，等大學里學到相關知識的時候會學到的。
⑦ 第二代DNA測序法的原理能解釋一下么主要想問：1.雙脫氧核苷酸終止子是什麼，標記熒光的部分是片段尾部
DNA測序的方法有很多種. 目前最常見的是雙脫氧終止法了. 在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶. 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸(稱為ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然後進行聚合反應. 在第一個反應物中, ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈, 由於其3位的羥基變成了氫, 所以不能繼續延伸. 所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產生的都是以C結尾的; 第三個反應的都以G結尾, 第四個反應的都以T結尾, 電泳後就可以讀出序列了. 也許這樣說你不一定明白. 舉一個例子, 假如有一個DNA, 互補序列是GATCCGAT, 我們試著做一下: 在第一個反應中由於含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三個鹼基時沒什麼問題, 但遇到A時, 摻入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一個如果參與反應的是ddATP則終止, 產生一個僅有2個核苷酸的序列: GA, 否則繼續延伸, 可以產生序列GATCCG, 又到了下一個A了. 同樣有兩種情況, 如果是ddATP摻入, 則產生的序列是GATCCGA, 延伸終止, 否則可以繼續延伸, 產生GATCCGAT. 所以在第一個反應系統中產生的都是以A結尾的片段: GA, GATCCGA, 同理在第二個反應中產生的都是以C結尾的片段: GATC, GATCC, 在第三個反應中產生的都是以G結尾的片段: G, GATCCG 在第四個反應中產生的都是以T結尾的片段: GAT, GATCCGAT, 電泳時按分子量大小排列, A反應的片段長度為2, 7; C反應的為4, 5; G反應的為1, 6; T反應的為3, 8, 四個反應的產物分別電泳, 結果為8 7 6 5 4 3 2 1 A | | C | | G | | T | | 我們可以從右向左讀, 為GATCCGAT, 至此, 測序完成(上面這個圖在網路知道中顯示不正常, 因為網路知道的網頁用的是比例字體, 你如果想看它, 拷貝到記事本中, 用等寬的字體來看).
1 cDNA 文庫的構建1.1 cDNA 文庫構建的基本原理與方法 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定)，要構建一個高質量的 cDNA 文庫，獲得高質量的 mRNA 是至關重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。由於 RNA 酶存在所有的生物中，並且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環境，因此建立一個無 RNA 酶的環境對於制備優質 RNA 很重要。在獲得高質量的 mRNA 後，用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成(用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應)，合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。這里強調的是對載體的選擇，常規用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源 DNA。1.2 cDNA 全長文庫 經典 cDNA 文庫的構建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 cDNA。為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉錄酶作用特點所導致的局限性。全長 cDNA 文庫，是指從生物體內一套完整的 mRNA 分子經反轉錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質序列進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等。目前所報道的對全長文庫的構建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 (Invitrogen，USA) 使用說明進行。判斷一個 cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。1.2.1 直接從序列上評價 5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應基因5'末端進行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起始點，一般加在5'帽結構後有一段富含嘧啶的區域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經過酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物已知的對應基因3'末端進行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。1.2.2 用實驗方法證實 可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE，3'端 RACE，或者通過 Northern Blot 證實大小是否一致。1.3 對 cDNA 文庫的分析 對 cDNA 文庫質量的評價主要有兩個方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細胞中表達信息(即 mRNA 種類)的完整性，它是體現文庫質量的最重要指標。文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數。庫容量取決於來源細胞中表達出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數，1個正常細胞含10000～30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細胞總計數群中所佔比例少於0.5％時。滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算( P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設為99％；N 為文庫中以 P 概率出現細胞中任何一種 mRNA 序列理論上應具有的最少重組子克隆數；n 為細胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數；
第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區，中間的編碼區和3'端非翻譯區。非翻譯區的序列特徵對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列則是合成基因產物—蛋白質模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應出天然基因的結構。2 cDNA 文庫構建的其它類型2.1 均一化 cDNA 文庫 它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達基因對應的 cDNA 的拷貝數相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進行均一化的理論。但該理論一直以來都被認為不能應用於實際。其主要限制因素是難以提供足量的極低表達豐度的 cDNA 用於飽和雜交，從而可能會造成部分基因的 cDNA 的丟失。20年前，基於 DNA-RNA 雜交的研究就已經將基因的轉錄水平分為高中低3類。隨後研究進一步表明，絕大多數基因是處於中等或低等表達豐度的，在單個細胞中含有近1～15個拷貝，而高豐度表達基因的轉錄產物在單個細胞中最高可達5000個左右拷貝，約占總表達量的25％。這種基因表達能力上的巨大差異成了獲得一個具有完整代表性的 cDNA 文庫的障礙，其表達量上的巨大差異更為大規模研究增添了困難。對單一組織的 cDNA 文庫而言，高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費，尤其是在大規模的 EST 測序中。均一化 cDNA 文庫是克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利於研究基因的表達和序列分析。現在，在構建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點：一種是基於復性動力學的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復性的速度快，而低豐度的 cDNA 復性要很長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種是基於基因組 DNA 在拷貝數上具有相對均一化的性質，通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。 第一種方法的掌握對技術的要求比較高，對多數人而言需要多次摸索才能找到最適條件；
⑧ 基因文庫構建的過程、原理及方法
1 cDNA 文庫的構建
1.1 cDNA 文庫構建的基本原理與方法
cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定)，要構建一個高質量的 cDNA 文庫，獲得高質量的 mRNA 是至關重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。由於 RNA 酶存在所有的生物中，並且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環境，因此建立一個無 RNA 酶的環境對於制備優質 RNA 很重要。在獲得高質量的 mRNA 後，用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成(用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應)，合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。這里強調的是對載體的選擇，常規用的是 λ 噬菌體，這是因為 λ DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全長文庫
經典 cDNA 文庫的構建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 cDNA。為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉錄酶作用特點所導致的局限性。全長 cDNA 文庫，是指從生物體內一套完整的 mRNA 分子經反轉錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還可以對蛋白質序列進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等。目前所報道的對全長文庫的構建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 (Invitrogen，USA) 使用說明進行。判斷一個 cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。
1.2.1 直接從序列上評價
5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應基因5'末端進行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起始點，一般加在5'帽結構後有一段富含嘧啶的區域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經過酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物已知的對應基因3'末端進行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。
1.2.2 用實驗方法證實
可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE，3'端 RACE，或者通過 Northern Blot 證實大小是否一致。
1.3 對 cDNA 文庫的分析
對 cDNA 文庫質量的評價主要有兩個方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細胞中表達信息(即 mRNA 種類)的完整性，它是體現文庫質量的最重要指標。文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數。庫容量取決於來源細胞中表達出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數，1個正常細胞含10000～30000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細胞總計數群中所佔比例少於0.5％時。滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算( P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設為99％；N 為文庫中以 P 概率出現細胞中任何一種 mRNA 序列理論上應具有的最少重組子克隆數；n 為細胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數；T 為細胞中表達出的所有 mRNA 的總拷貝數)。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區，中間的編碼區和3'端非翻譯區。非翻譯區的序列特徵對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列則是合成基因產物—蛋白質模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應出天然基因的結構。
2 cDNA 文庫構建的其它類型
2.1 均一化 cDNA 文庫
它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達基因對應的 cDNA 的拷貝數相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進行均一化的理論。但該理論一直以來都被認為不能應用於實際。其主要限制因素是難以提供足量的極低表達豐度的 cDNA 用於飽和雜交，從而可能會造成部分基因的 cDNA 的丟失。20年前，基於 DNA-RNA 雜交的研究就已經將基因的轉錄水平分為高中低3類。隨後研究進一步表明，絕大多數基因是處於中等或低等表達豐度的，在單個細胞中含有近1～15個拷貝，而高豐度表達基因的轉錄產物在單個細胞中最高可達5000個左右拷貝，約占總表達量的25％。這種基因表達能力上的巨大差異成了獲得一個具有完整代表性的 cDNA 文庫的障礙，其表達量上的巨大差異更為大規模研究增添了困難。對單一組織的 cDNA 文庫而言，高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費，尤其是在大規模的 EST 測序中。
均一化 cDNA 文庫是克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利於研究基因的表達和序列分析。現在，在構建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點：一種是基於復性動力學的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復性的速度快，而低豐度的 cDNA 復性要很長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種是基於基因組 DNA 在拷貝數上具有相對均一化的性質，通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。第一種方法的掌握對技術的要求比較高，對多數人而言需要多次摸索才能找到最適條件；而後一種方法易於掌握，但有研究者根據復性動力學的原理也提出了其不利因素，即採用基因組 DNA 飽和雜交的方法會因為低拷貝的表達基因拷貝數少而無法被雜交上。目前已報到的均一化 cDNA 文庫多是根據第二種原理構建的，常用策略有基於 PCR 技術利用 cDNA 多次復性 mRNA-cDNA 雜交等。有研究報道，針對各自選擇的高表達靶序列進行分析後，均一化處理後文庫的高豐度表達 cDNA 是處理前的0.3％～2.5％，基本滿足節約篩選的要求。
均一化 cDNA 文庫具有以下4方面的優點：第一，在經濟上具有廣泛的應用空間，可以節約大量試驗成本。第二，增加克隆低豐度 mRNA 的機會，適用於分析各種發育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三，與原始豐度的 mRNA 拷貝數相對應的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫作雜交，可以估計出大多數基因的表達水平及發現一些組織特異的基因。而以往的文庫構建，忽略了 mRNA 豐度的影響。第四，可以用於遺傳圖譜的製作和進行大規模的原位雜交，作為優化的文庫系統還可以用於大規模的測序或晶元製作等研究。
2.2 差減 cDNA 文庫 (Subtractive cDNA library)
差減文庫也稱扣除文庫，使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個別功能或特性上不同的材料(如不同基因處理細胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反轉錄後合成 cDNA)，在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅動子( Driver )與含有目的基因的試驗方( Tester )進行雜交，選擇性的祛除兩部分共同基因雜交形成的復合物，往往進行多次的雜交—祛除過程，最後將含有相關目的基因的未雜交部分收集後，並連接到載體形成文庫。消減雜交是構建差減 cDNA 文庫的核心，差減文庫是否構建成功很大程度上決定於差減雜交的效率。差減雜交的方法主要有(1)羥基磷灰石柱層析法 (HAP)；(2)生物素標記、鏈親和蛋白結合排除法；(3)限制性內切酶技術相結合的差減方法；(4)差減抑制雜交法 (SSH)；(5)磁珠介導的差減法 (MAST)，其中 SSH 法最為常用。
抑制性消減雜交技術 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人於1996年依據消減雜交和抑制 PCR 發展出來的一種分離差異表達基因的新方法，主要用於分離兩種細胞或兩種組織的細胞中的差異表達基因。它主要是利用抑制 PCR 對差減雜交後豐度一致的目的材料中兩端連有不同接頭的差異表達片段進行指數擴增，而兩端連接上同一接頭的同源雙鏈片段僅呈線形擴增，從而達到富集差異表達基因的目的。因此應用該技術能夠對兩個有差異表達的材料(細胞或組織)高、中、低豐度目的基因都進行有效、快速、簡便克隆。近年來已成功應用於植物發育、腫瘤與疾病、以及外界因子誘導組織細胞中相關的應答基因的分析和克隆。
2.3 固相 cDNA 文庫構建
cDNA 的固相合成是人們早為熟知的技術，但局限之處 oligo(dT) 與纖維素膠粒或磁珠的結合比較牢固，將 cDNA 洗脫下來時得率不是很高，而且以後的反應步驟也不能都在介質上進行，這可能是該技術應用並不十分廣泛的原因。
最近 THOMAS ROEDE 提出了一種新的 cDNA 文庫固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文庫構建中存在的缺點，所用的酶和試劑與傳統方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修飾均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA 通過一個生物素固定在鏈黴素偶聯的磁珠上，這樣在反應過程中就可以簡便而迅速的實現酶和緩沖液的更換，因此它將快速與高質量的文庫構建結合在一起(構建文庫只需1 d)，並且構建的文庫適合大多數的研究目的。
固相 cDNA 合成法的主要優點是可以簡便 cDNA 合成的操作。在進行緩沖液更換時既沒有 cDNA 的丟失之憂，也無其它物質污染之憂。另外，用此方法可以得到真實的代表性文庫，它包含有短小的 cDNA，這是因為在克隆之前省去了分級分離的步驟。總之，固相法結合了傳統的 cDNA 合成的優點並彌補了其不足。這種方法簡便易行，可靠低廉，所建文庫高質量，因此它可能會替代目前應用的 cDNA 文庫操作方法。
另外，最近發展起來的微量 RNA 的 cDNA 構建，是使用 PCR 技術，在實驗室條件下擴增的 mRNA 的 cDNA 量，其 PCR 檢測的靈敏度遠遠大於反轉錄 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文庫的構建可為有關微量活性物質遺傳基因的研究提供方便。
3 cDNA 文庫應用於分離新基因的方法
發現並分離克隆新基因始終是分子生物學研究的主要任務和目的，雖然 cDNA 文庫的用途很多，但是，應用於分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的 cDNA 文庫，都可以用於分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對於非全長 cDNA 文庫，即不管是經典的 cDNA 文庫方法或差減法構建的 cDNA 文庫，需要利用已經獲得的新 cDNA 序列片段，通過 RACE 方法獲得新基因的全長序列。第二，利用全長 cDNA 文庫與目的基因片段作為探針的雜交篩選。
3.1 從非全長 cDNA 文庫中篩選新基因
3.1.1 RACE 法
RACE 文庫即快速擴增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 內很短的一段序列即可擴增出其 cDNA 的5'(5' RACE )和3'端(3' RACE )。該法的主要特是利用一條根據已知序列設計的特異性引物和一條與 mRNA 的 PolyA (3' RACE )或加至第一鏈 cDNA 3'端的同聚尾(5' RACE )互補的通用引物，由於同聚體並非良好的 PCR 引物，同時為了便於 RACE 產物的克隆，可向同聚體引物的5'端內加入一內切酶位點。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3'，5'-RACE 均可)。當 RACE PCR 產物為復雜的混合物時，可取部分產物作模板，用另一條位於原引物內側的序列作為引物與通用引物配對進行另一輪 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，FROHMAN 等即用此方法成功地獲得了4種 mRNA 的5'合3'末端序列。
迄今已有幾種改良的 RACE 方法，通過修飾與優化，與最初的 FROHMAN 報道有所不同：(1) BARSON 等採用鎖定寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸引物「鎖定」基因特異性序列的3'末端與其 Poly (A) 尾的連接處，進行第1條 cDNA 鏈的合成，消除了在合成第1條 cDNA 鏈時寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位結合而帶來的影響。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小組利用 T4 RNA 連接酶把寡核苷酸連接到單鏈 cDNA 的5'末端，然後用一個3'末端特異性引物和一個錨定引物就可以直接對錨定連接的 cDNA 進行體外 PCR 擴增和克隆。隨後，BERTLING 等又用 DNA 連接酶代替 RNA 連接酶。這些方法都避免了在第2條 cDNA 鏈內同聚序列區互補而導致截斷 cDNA 的產生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，採用的引物為基因特異性的，所以非特異性 PCR 產物基本上不會產生。Clontech 等公司也根據 RACE 法的更新，相繼推出了 RACE 的相應試劑盒，為克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 試劑盒克隆了一種含有類植物血凝素免疫受體 ITIM。
3.1.2 用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因
通過對文庫的篩選或適用簡並引物進行 PCR 反應，常常只能獲得不完整的 cDNA 片段。為了得到 cDNA 全長，常常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大，RACE 雖然為此提供可方便，但應用該方法需重新提取 mRNA 和反轉錄。而用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌體 DNA，按保守序列設計 PCR 引物便可將未知片段進行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區域保守的情況下，用 PCR 法很容易獲取 cDNA 的全長。同一轉錄產物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時將不同拼接方式的克隆篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴增後，有利於觀察到不同的拼接方式。另外，為研究基因在不同組織中表達情況，常根據差異顯示法找出特異的 mRNA。
3.2 從全長 cDNA 文庫中進行雜交篩選
3.2.1 標記探針 cDNA 文庫篩選法
cDNA 文庫通常塗抹到母盤培養基上，然後再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時加入標記的探針，如果出現雜交信號，那麼從母盤上就可以把包含雜交信號的菌落分離、培養出來。以此篩選出陽性克隆，進行序列分析，以獲得 cDNA 全長。該方法能避免 PCR 擴增的非特異性擴增或錯配，是一種比較准確可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺點是克隆過程需要一系列的酶促反應、產率低、費時長、工作量大。該方法適合於表達豐度高的基因的篩選分離。用於做標記探針的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在這種情況下篩選出來的基因往往是已分離基因的同源基因；如果用於做標記探針的 DNA 片段是通過新分離蛋白質的氨基酸反推設計的 DNA 序列，或者是特異分子標記子 DNA 序列，那麼可以篩選得到新功能基因。
3.2.2 反式 PCR
反式 PCR 克隆 cDNA 全長的基因原理是：雙鏈 cDNA 合成後進行尾—尾連接，環化的 cDNA 用位於已知序列內的限制性內切酶酶切位點造成缺口或用 NaOH 處理使之變性，然後用2條基因特異性引物對重新線性化或變性的 cDNA 進行擴增。反式 PCR 的優勢在於，它採用了2條基因特異性引物，因此不易產生非特異性擴增。該方法可以快速、高效地擴增 cDNA 或基因組中已知序列兩側位置的片段。
4 小結
隨著生物及信息技術的迅速發展，尋找新基因、克隆新基因、進而研究基因的功能已成為功能基因組研究中的一項重要工作。在過去尋找新基因的方法中，以消減雜交、mRNA 差異顯示，cDNA 的代表性差異顯示分析法、差異消減展示等方法應用最廣。這些方法在新基因的發現方面都各有其獨特的優勢，可尋找出一些差異表達序列，但這些差異表達序列大部分情況都是不完整的基因。目前，比較可行而且應用較多的方法主要還是 cDNA 文庫的篩選。一方面 cDNA 文庫只代表一定時期一定條件下正在表達的基因，是整個真核基因組中的少部分序列，因此 cDNA 克隆的復雜程度比直接從基因組克隆的要小得多；另一方面由於每個 cDNA 克隆只代表一種 mRNA 序列，因此在基因克隆過程中出現假陽性的概率比較低，所以 cDNA 文庫的構建已成為當前分子生物學研究和基因工程操作的基礎。本文涉及到的有關 cDNA 文庫構建方法，是目前比較常用的，這些方法各有優缺點，研究者應根據自己的實際情況，選擇合適的技術，已達到自己預期的目的。
⑨ DNA測序可以採用哪些手段，並闡述各自的原理
這位是搞分子生物學的嗎?
DNA測序的方法有很多種. 目前最常見的是雙脫氧終止法了. 在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶. 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸(稱為ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然後進行聚合反應. 在第一個反應物中, ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈, 由於其3位的羥基變成了氫, 所以不能繼續延伸. 所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產生的都是以C結尾的; 第三個反應的都以G結尾, 第四個反應的都以T結尾, 電泳後就可以讀出序列了. 也許這樣說你不一定明白. 舉一個例子, 假如有一個DNA, 互補序列是GATCCGAT, 我們試著做一下:
在第一個反應中由於含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三個鹼基時沒什麼問題, 但遇到A時, 摻入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一個如果參與反應的是ddATP則終止, 產生一個僅有2個核苷酸的序列: GA, 否則繼續延伸, 可以產生序列GATCCG, 又到了下一個A了. 同樣有兩種情況, 如果是ddATP摻入, 則產生的序列是GATCCGA, 延伸終止, 否則可以繼續延伸, 產生GATCCGAT.
所以在第一個反應系統中產生的都是以A結尾的片段:
GA, GATCCGA,
同理在第二個反應中產生的都是以C結尾的片段:
GATC, GATCC,
在第三個反應中產生的都是以G結尾的片段:
G, GATCCG
在第四個反應中產生的都是以T結尾的片段:
GAT, GATCCGAT,
電泳時按分子量大小排列, A反應的片段長度為2, 7; C反應的為4, 5; G反應的為1, 6; T反應的為3, 8, 四個反應的產物分別電泳, 結果為
8 7 6 5 4 3 2 1
A | |
C | |
G | |
T | |
我們可以從右向左讀, 為GATCCGAT, 至此, 測序完成(上面這個圖在網路知道中顯示不正常, 因為網路知道的網頁用的是比例字體, 你如果想看它, 拷貝到記事本中, 用等寬的字體來看).
⑩ 生物學 EST是什麼啊 詳細的介紹一下
EST是Expressed Sequence Tag的縮寫，意思是表達序列標簽，指從一個隨機選擇的cDNA克隆，進行5』端和3』端單一次測序挑選出來獲得的短的cDNA 部分序列。
EST是從一個隨機選擇的cDNA 克隆進行5』端和3』端單一次測序獲得的短的cDNA 部分序列，代表一個完整基因的一小部分，在資料庫中其長度一般從20 到7000bp 不等，平均長度為360 ±120bp。
EST 來源於一定環境下一個組織總mRNA 所構建的cDNA 文庫，因此EST也能說明該組織中各基因的表達水平。
(10)計算機網路cdna公式擴展閱讀
EST的作用表現在：
1、 用於構建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜；
2、作為探針用於放射性雜交;
3、 用於定位克隆；
4、藉以尋找新的基因;
5、作為分子標記；
6、 用於研究生物群體多態性。